2022年5月31日，南京中医药大学医学院﹒整合医学学院病原生物学系林炜教授课题组在国际知名学术期刊Nucleic Acids Research（中科院生物医学一区，IF=16.971）在线发表了题为“Structural basis of transcription activation by Rob, a pleiotropic AraC/XylS family regulator”的研究论文，首次揭示了细菌AraC家族转录调控因子Rob对革兰氏阴性病原菌多药耐受基因的转录激活调控机制，为抗耐药菌感染药物的研发提供了新型靶点和研究思路。该工作是林炜教授团队继 (Mol. Cell., 2017)、(Mol. Cell., 2018)、(Nat. Commun., 2019)、(Nucleic. Acids Res., 2020) 、(Nucleic. Acids Res., 2021)之后在病原菌转录调控和新型抗耐药菌药物靶点发现领域取得的又一项全新研究成果。

        近年来，随着抗生素的滥用和监管不足，细菌的抗生素耐药现象日趋严峻，已对全球公共卫生安全构成巨大威胁，专家预测至2050年抗生素耐药每年将会导致世界上1000万人死亡，高于恶性肿瘤致死人数，其中鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等革兰氏阴性病原菌属于重点耐药性细菌，开发靶向得新型抗耐药菌感染药物及治疗策略已成为公共卫生领域的迫切要求。转录调控是细菌核心的生命活动，细菌利用转录因子时序性精准激活耐药基因转录是细菌产生致病与耐药的重要调控环节，因此，从转录水平探究革兰氏阴性病原菌的耐药调控机制，将对新型抗耐药菌药物靶点的发现及治疗策略改进具有重要指导意义。

        细菌AraC家族蛋白广泛分布于霍乱弧菌、鼠疫耶尔辛杆菌等革兰氏阴性病原细菌中，可通过转录激活应激基因调控网络，在细菌感染、致病与耐药方面发挥重要调控功能。研究表明，Rob蛋白是细菌AraC家族蛋白中的一种多效性转录激活因子，可通过与RNAP作用，拮抗外膜转运蛋白OmpF的翻译、激活药物外排泵acrAB-tolC、碳代谢途径中关键酶及生物膜形成相关基因的表达，使细菌对抗生素、有机溶剂等产生耐受与抗性，增强细菌的致病与耐药性。除N端（Rob NTD）具有细菌AraC家族蛋白特有的识别DNA的保守螺旋-转角-螺旋基序（HTH motif）外，Rob蛋白的最大特点是具有大的C末端结构域（Rob CTD），体内实验研究表明Rob CTD不仅可保护Rob NTD免受细胞蛋白酶的降解，而且在化合物存在条件下，可使Rob从“抑制态”转变为“激活态”，但其具体分子调控机制仍不清楚。

        通过采用单颗粒冷冻电镜技术（Single particle Cryo-EM），我校林炜教授团队克服了研究瓶颈问题，最终解析了含大肠杆菌RNA聚合酶、耐药调控基因启动子micF与大肠杆菌Rob蛋白的转录激活复合物Rob-TAC的电镜结构，成功捕获了Rob单体的转录激活状态（图1）。研究证明 Rob与 RNA聚合酶的C末端结构域、σ70R4结构域同时发生相互作用，阐明了此类作用力在细菌转录激活调控中的重要意义。除阻碍RNA聚合酶σ70R4结构域结合启动子的-35元件外，酸性环（acidic loop）可辅助稳定Rob NTD与保守rob结合元件间的特异性相互作用。另外，配体对接和生化实验分析表明，Rob CTD与普遍存在的Gyrl样结构域具有高度结构相似性，可通过识别结合配体发生“别构调节”功能，进而促进Rob-TAC的形成。该研究阐明了Rob介导的多种关键蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互作用，回答了Rob如何通过“招募”和“别构调节”机制促进耐药调控基因转录，进而拮抗外膜转运蛋白OmpF翻译，增强细菌抗生素耐药的关键科学问题，同时也揭示了其在AraC家族蛋白中的普遍调控意义，可为新型抗耐药菌感染药物的研发提供新的靶点和研究思路。

图1  Rob蛋白的转录激活复合物结构及其调控机制

        南京中医药大学副教授史婧为该论文的第一作者和共同通讯作者；博士研究生王福林、硕士研究生李芳芳和王璐为该论文的共同第一作者；林炜教授为该论文的最后通讯作者。本研究获得了国家自然科学基金面上项目（82072240）、青年项目（81903526、32000025）；江苏省自然科学基金项目（BK20190798、BK20211302）；江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目（ZDXM-2020-10）；南京中医药大学一流学科开放课题项目（2020YLXK008、2020YLXK016）及教育部霍英东青年教师基金等项目资助。

原文链接如下：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac433/6596093